AP最前沿急性胰腺炎动物模型中组织蛋
急性胰腺炎是一种复杂性的疾病，它的发病机理包括早期的细胞内蛋白酶激活以及炎症细胞的入侵。在生理条件下，消化蛋白酶被分泌为未激活的前体酶以及仅在十二指肠中被刷状缘酶激活的肠肽酶(PRSS7等肠激酶)。胰蛋白酶在急性胰腺炎中起着关键作用，一旦激活，它就能以类似于级联反应的方式激活其他多种蛋白酶。
胰蛋白酶本身是由溶酶体酶组织蛋白酶B(CTSB)、限制性蛋白酶解或自体活化所激活的。CTSB在激活胰蛋白酶原中所扮演的角色已在体外、间接体内和体内的环境中被证实。
组织蛋白酶D(CTSD)是一种溶酶体的天冬氨酸蛋白酶，几乎是被广泛地表达的。就像其他的组织蛋白酶一样，它以一种非活化的初前形式被合成，在溶酶体内被转化为酶原，包装成它的成熟形式。活化的CTSD存在于由双硫桥连接的氨基端光链(14kDa)和一个羧基末端重链(34kDa)组成的双链结构中。不同于CTSB或CTSL，组织蛋白酶D在生理条件下不是分泌蛋白。CTSD涉及多种细胞功能，如蛋白质降解和细胞死亡，并与癌症和神经退化性疾病的发展有关。在人类中，CTSD遗传性的纯合子缺乏导致了致命的神经细胞类脂质脂褐化病早发。
半胱氨酸和天冬氨酸蛋白酶CTSB和CTSL之间的相互作用被认为参与了CTSD作用过程。鉴于CTSB和CTSL在调节胰蛋白酶原活化和疾病严重性方面的重要作用，我们对CTSD的作用进行了研究。为此，我们使用了两种不同的基因工程小鼠的急性胰腺炎的实验模型，其中一种是完全敲除(CTSD-/-)，另一种是胰腺特定的敲除(CTSD/p48cre/+)。数据表明，CTSD是CTSB的有效激活剂，通过激活CTSB，调节它对胰腺炎的严重程度的影响，并且主要在于对炎症细胞的影响。
1.分离腺泡细胞内，给予最大量CCK刺激，胰腺内的CTSD表达和细胞内活化
在C57BL/6胰腺组织的免疫组织化学反应中显示CTSD在腺泡细胞的基底外侧，而CTSD-/-胰腺显示没有CTSD表达(Fig.1A)。用一种特殊的荧光CTSD基板来测定腺泡细胞的酶活性，证实了在腺泡细胞中CTSD的存在(Fig.1B)。CTSD抗体检测到两个不同的带，大小分别为30kDa和43kDa，与CTSD成熟形(ca33kDa)和前体(ca.46kDa)相对应，而被敲除的组织则没有CTSD表达(Fig.1C)。在前期试验中，我们测试了一种抗体，用于检测纯化的重组CTSD酶(来自脾脏的人类CTSD)，在30kDa上显示了相同的条带。
在对急性胰腺炎的间接体内试验中，适应最大剂量肠促胰酶肽来刺激分离的腺泡细胞，细胞内的CTSD活性迅速增加，最多可达20分钟，随后下降。在缺乏CTSD的腺泡细胞(CTSD-/-)中没有观察到CTSD活性。未受刺激的腺泡细胞在体外培养时CTSD活性中没有相关的变化(Fig.1D)。
在CTSDf/f/p48Cre/+小鼠中活化的CTSD的残余表达。在这些动物中p48(Ptf1a)启动子在腺泡细胞中清除CTSD，而不是在导管或内分泌细胞或定居吞噬细胞中，这解释了弱信号的存在的原因(Fig.1E)。通过荧光测定CTSDf/f/p48Cre/+腺泡细胞来确定CTSD的活性显示CTSD表达缺失，经过最大剂量的CCK刺激后，未检测到CTSD活性(Fig.1F)。使用蛋白免疫组化对CTSDf/f/p48Cre/+腺泡细胞的蛋白表达分析证实了CTSD的缺失(Fig.1G)，这与荧光测定结果一致。
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2.胰蛋白酶原和蛋白酶B的活化依赖于组织蛋白酶D
为研究细胞内蛋白酶的活化是否依赖于CTSD，我们从CTSD-/-小鼠中分离出腺泡细胞，并以CCK刺激它们，最多可达60分钟。CTSD的缺失阻止了约75%胰蛋白酶原活化(Fig.2A)和CTSB(Fig.2B)活化。这些观察结果从胰腺特异性CTSD敲除(CTSDf/f/p48Cre/+小鼠)(Fig.2C、D)中得到证实。
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为进一步阐明CTSD在CTSB激活中所起的作用，我们从野生型小鼠胰腺中得到免疫沉淀的CTSB，并增加重组，活化人类CTSD到样本(10μU)。未处理的CTSB免疫沉淀物的免疫印迹显示了在ca25kDa上一种带着微弱信号的带状模式，在添加CTSD后，这一信号变得更加突出。活化的组织蛋白酶B的分子量大约在25kDa，因此，这一波段的强度增加表明CTSD激活CTSB(Fig3A)。25kDa波段的密度测定结果显示，在30分钟后，其强度显著增强，在60分钟的CTSD潜伏期后仍显著增加。对CTSD的任何交叉反应都被排除在体外试验中，在这种试验中，CTSB抗体检测到没有重组CTSD。重组CTSD酶和共同调节CTSD的免疫沉淀物片段在30kDa中有一个较重的带。除了在34kDa和25kDa上的活化组织蛋白酶B外，在未处理的CTSD前体中还会在30kDa和24kDa上出现另外的一些带，在CTSD处理过程中消失了，这表明了非特异性免疫反应产物或者是CTSD的轻微的、额外的降解作用。
为了确认CTSB的激活，我们用生物素耦合的底物NS-共孵育免疫沉淀物，NS-是一种基于环氧基的CTSB的特殊试剂，它与处理后CTSB的活性位点结合，而不是它的非活性前体，因此可以对活性CTSB进行高度敏感和选择性的检测。随后的CTSD培养导致了NS-的增加，表明活化的CTSB的增加(Fig.3B)。
利用CTSB基质AMC-Arg2及其添加到CTSB免疫沉淀中进行荧光组化，获得CTSD活性对CTSB激活的进一步证据。在与CTSD的共同孵化后，我们发现了CTSB活性的增加(Fig.3C)。CTSD活性的亚细胞分布与CTSB的相似。在静息状态下，CTSD在溶酶体和包含室的酶类中都发生了变化，而CTSD的转移则是在第一次雨蛙素的注射后1小时发现的，这与CTSB很相似(Fig.3D)。Figure3E演示了在休息条件下的亚细胞分数中标记蛋白的分布。酶原标记物主要在分泌囊泡片段中发现，溶酶体标记物LAMP-2和LIMP-2在溶酶体片段和胞腔内的GAPDH中发现。为了澄清CTSD是否直接激活胰蛋白酶原，我们在体外与胰蛋白酶原联合培养CTSD，并在3小时的潜伏期后免疫印迹中没有检测到裂解条带。相比之下，肠肽酶，一种胰蛋白酶原激活剂在30分钟后(Fig.3F)裂解胰蛋白酶原。CTSD的缺失对胰蛋白酶原表达没有影响，因为C57BL/6野生型和CTSD-/-小鼠的胰腺中含有类似数量的肠肽酶活性胰蛋白酶活性。
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3.根据敲除模型，组织蛋白酶D的缺失改变急性实验性胰腺炎的严重程度
为寻找CTSD调节急性胰腺炎的严重程度的意义，我们在CTSDf/f/p48Cre/+和CTSD-/-小鼠以及相应的同窝出生仔控制组(CTSDf/f和C57BL/6小鼠)塑造了雨蛙素诱导的急性胰腺炎模型。正如在腺泡细胞中所做的间接体外实验所预测的那样(Fig.2)，与CTSD和CTSB的激活(Fig.4A)和胰蛋白酶的活化(Fig.4B)相比，CTSDf/f/p48Cre/+小鼠在早期的时间(1小时)降低了胰腺炎的严重程度。CTSDf/f/p48Cre/+小鼠在胰腺炎1小时表现出血清脂肪酶减少（Fig.4C），髓过氧物酶(MPO)（一种中性粒细胞酶，在胰腺细胞质中）的活性减少（Fig.4D），显示疾病严重程度减少。在胰腺炎(Fig.4E)的早期(1h)或晚期(8h)的时间点，全组织未受损伤影响。8h的腺泡的特异性缺失CTSD(CTSDf/f/p48Cre/+老鼠)对CTSB(Fig.4A),胰蛋白酶激活(Fig.4B)或任何疾病严重程度的参数(Fig.4C,D,E)没有影响。CTSDf/f/p48Cre/+中剩余CTSD活性可归因于定植和浸润炎症细胞(Fig.4F)。在CTSDf/f/p48Cre/+和控制组在1h之间有中性粒细胞数目不同，但在8h中没有差异，与MPO活性相似。
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使用CTSD-/-模型时，结果是完全不同的。在这些实验中，我们在出生14天时使用了CTSD-/-和野生型控制(C57BL/6)，以避免在年老动物身上发生肠道萎缩和淋巴细胞流失的影响，并集中在胰腺炎的晚期(8h)阶段。与腺泡的细胞特异性缺失CTSD不同，CTSD在所有细胞的完全缺失，包括炎症细胞，不仅大大降低CTSB(Fig.5A)和胰蛋白酶(Fig.5B)的激活，而且8h疾病严重性降低，表现为血清脂肪酶(Fig.5C)降低和减少累积的组织学损伤(Fig.5D)。综上所见，这些数据表明，腺泡细胞的CTSD、CTSB和胰蛋白酶级联是对胰腺炎的最终严重程度的微小而短暂的重要性，而CTSD在胰腺炎中所扮演的角色主要是由非腺泡细胞引起的。
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4.CTSD-/-骨髓细胞在LPS刺激后显示细胞因子释放减少
根据我们的观察,在一个最迟时间点，胰腺炎严重度在CTSD-/-小鼠中降低，不是CTSDf/f/p48Cre/+老鼠；来自动物的腺泡细胞对于CCK刺激下CTSB和胰蛋白酶活化显示出类似的反应，我们得出结论,对疾病严重程度的影响可以由胰腺内或浸润的炎症细胞来介导。因此，我们将免疫细胞从CTSD-/-小鼠的骨髓中分离出来，并将其置于体外的脂多糖(LPS)刺激中。在上清液中对免疫细胞中细胞因子TNF–α、白细胞介素6、IL-10、IFN-γ和MCP-1的定量测量，结果显示6小时LPS刺激后CTSD-/-骨髓细胞中细胞因子产生显著降低(Fig.6)。这些结果表明,炎症细胞的细胞因子的产生在CTSD清除后大大受损。
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5.CTSD的缺失可以减少胰腺炎在两种不同的敲除模式下的细胞凋亡。
急性胰腺炎的细胞死亡可以包括坏死和腺细胞凋亡，而后者则被认为是较温和的表现型。因此,我们调查是否清除CTSD会导致坏死和凋亡转向考虑减少疾病严重程度在胰腺腺泡细胞8小时后减轻。我们的研究结果表明，事实上完全相反，CTSD-/-腺泡细胞以及CTSDf/fp48Cre/+动物显示在最大剂量的CCK刺激下，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3活化减少(Fig.7A)。在体内，在胰腺炎8h后，在CTSD清除的动物中，TUNEL阳性的数目和细胞凋亡的数量减少到50%，这表明，腺泡细胞CTSD对于胰腺组织细胞凋亡进展是至关重要的，它与炎症细胞的CTSD无关。
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结论
我们的结论是，与半胱氨酸蛋白酶CTSL和CTSB相比，天冬氨酸蛋白酶CTSD是在胰腺中表达的，并在最大剂量CCK刺激下经历亚细胞的再分配。它对细胞损伤的影响是通过CTSB介导的，CTSB是一种有效的活化剂，而不是直接激活胰蛋白酶原。CTSD缺失的腺泡细胞在影响最终的疾病严重性方面只是暂时的，而从炎症细胞中缺失CTSD则会削弱细胞因子产生的能力并且在胰腺炎的病程中会有更持久的影响。
施笑蕾叶博赞赏
